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结核性脑膜炎的脑脊液检测

 

发布时间: 2014年09月10日   出处:检验医学中心  作者:姜楠  编辑:xzd    点击次数:10677

    结核性脑膜炎( tuberculous meningitis, TBM)是神经系统结核病中最常见的疾病,也是死亡率最高的肺外结核疾病。其预后与早期诊断和早期治疗有密切关系。因此,人们正在致力于提高TBM 的早期诊断的探索中。但是, 对于TBM 的诊断一直缺乏有力的手段。脑脊液实验检测在诊断TBM中起到关键的作用。本文就TBM的脑脊液实验室检测的进展作一综述。

    一、脑脊液病原学检测

    (1)脑脊液培养

    脑脊液分离培养结核分枝杆菌的条件要求高,培养周期长,且阳性率不高。 改良版罗氏培养基培养结核分枝杆菌需要长达八周的时间,而且阳性率也只是在45%-90%之间【1】。最近用快速培养仪如BACTEC-MGIT960 系统、ESP 仪检测系统、快速液体分离培养基等, 可以明显提高分离抗酸杆菌的阳性率和缩短培养时间, 且操作简便, 但试剂较昂贵, 短期难于推广。显微镜观察药敏试验法(microscopic observation drug susceptibility, MODS)是一种液体培养结合显微镜观察的技术。结核分枝杆菌在液体培养基中生长迅速,并能形成索状结构,容易在倒置显微镜下观察。MODS较常规培养法的检测时间可提早2~6周,而且具有很高的敏感度和特异度,可用于结核性脑膜炎的早期快速诊断。

    (2)脑脊液涂片找抗酸杆菌

    脑脊液抗酸染色的灵敏度是10%-87%,重复进行抗酸染色可以使灵敏度提高到37%-87%,阳性率很低, 难以早期发现【2】。有的实验室使用玻片离心沉淀法收集脑脊液细胞, 并进行抗酸染色,可提高阳性率, 但是该方法费时费力, 很难普及。

    二、脑脊液免疫学检测

    (1) 脑脊液免疫球蛋白的测定

    结脑时, 脑脊液IgG明显升高, 高于病毒性脑炎和化脓性脑膜炎; 脑脊液免疫球蛋白测定对鉴别结脑与其他脑部疾病有一定意义。TBM 患者CSF中以IgG和IgA增高为主, IgM 亦增高。病毒性脑膜炎CSF中仅有IgG轻度升高, IgA 及IgM 不升高, 故CSF中IgM 测定有助于TBM 诊断【3】。许多学者想通过对结核病患者这些指标的检查作为结核病诊断的辅助手段或疗效观察的指标,但临床工作中发现脑脊液中免疫球蛋白的测定不能作为结核性脑膜炎诊断的确切依据。

    (2)抗结核抗体检测

    关于结核抗体检测的敏感性和特异性多数报道为50% - 85%、80%- 90% 。王莉等【4】 报告, CSF 中PPD-IgG 在结脑早期的阳性率为80. 4% 。BeraS 等【5】采用间接ELISA 的方法来测定CSF IgG 抗体, 结果其敏感性和特异性分别是85% 和96%。KashyapRS等【6】采用抗体捕获ELISA 的方法测定CSF 中抗结核杆菌30 KD 蛋白抗原IgG 抗体来诊断TBM, 敏感性和特异性分别为80%和91% 。

    抗体检测不能分辨是急性结核感染或以前感染过结核, 并且对免疫损害患者的敏感性下降。结核抗体也可以从其他颅内炎症、脑血管病以及颅内肿瘤患者的脑脊液中检测到。血脑屏障受损而通透性增加时, 结核抗体进入脑脊液中, 出现假阳性。一些研究表明,在结核感染后抗体滴度在很长一段时间内维持在较高水平而与病情无关。由于不同蛋白的抗体检测结果对结核性脑膜炎诊断的敏感度和特异度不同,因此寻找特异度与敏感度更高的抗体检测技术一直是研究人员的目标。

    (3)结核抗原检测

    由于机体受到结核杆菌感染后, 体内首先出现的是结核抗原, 故结核抗原的检测可以作为结核杆菌存在的直接证据。脑脊液结核抗原测定的敏感性多在72. 6% - 86. 4%, 特异性在85. 1% -94. 2%。MudaliarAV 等【7】 采用间接ELISA 的方法并且使用单克隆抗体来测定160 份CSF 标本中的65KD 热休克蛋白抗原来诊断TBM, 其敏感性为84%,特异性为90% 。KashyapRS 等【8】用斑点EIISA 来测定H37Rv 抗原, 结果56 例TBM 中阳性率86%, 100例对照中阳性5% 。何俊瑛等【9】将30 例TBM 患者与30 例对照组进行CSF 常规、生化、细胞学检查, 同时用免疫荧光法检测CSF 中单核巨噬细胞内的结核抗原, 敏感性为83. 3%, 特异性为100% 。国外有学者用免疫细胞化学的方法进行脑脊液单核细胞内抗原的检测, 认为这种方法是一种更加简单的对TBM 患者早期诊断有价值的方法。有研究报道【10】,脑脊液单核细胞内ESAT-6抗原的检测35例结核性脑膜炎患者中,经免疫细胞化学染色有29例阳性,对照组中有2例阳性,ESAT-6抗原的敏感性为82.86%,特异性为94.29%。免疫细胞化学染色法联合免疫荧光双标记染色法可提高检出率。ESAT-6抗原的特异性大于PPD抗原。最早在发病3天,最晚在发病180天可检测出结核抗原。何俊瑛等【11】用免疫组化的方法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6,诊断TBM的敏感性为70% ,特异性为95%,检测脑脊液单核细胞中ESAT-6是诊断结核性脑膜炎的一种简便、特异的方法。

    尽管结核特异性抗原检测技术对于结核性脑膜炎的早期诊断具有重要意义,但因抗原检测需要特异性抗体,而目前还较难获得特异性高、活性强的结核特异性单克隆抗体,因此影响到结核抗原检测技术的应用,故今后仍需加强研究。

    (4)细胞因子的测定

    治疗后脑脊液中TNF-α、sTNFR-1 和sTNFR-2 含量与结脑感染有关, 其水平动态变化可作为判断结脑病情及治疗有效的一种指标【12】。Caws等【13】的研究指出在结核性脑膜炎患者中TNF明显升高, 但在结核性脑膜炎患者与正常组之间有重叠, 因而不能作为鉴别诊断的手段。Juan RS 等【14】采用放射免疫测定法( radioimmunoassay, RIA) 测定CSF 中INF-γ的含量, 认为以INF-γ> 6.4U/ ml 诊断TBM 时敏感性为70%, 特异性为94%。黄建敏等【15】采用放射免疫法测定TNF-α和IL-1在TBM患者CSF中的含量变化, 结果TBM患者CSF中TNF-α和IL-1在抗结核治疗前均较对照组显著升高, 随着抗结核药物治疗的进行, 患者病情逐步缓解, IL-1 显著下降, 而TNF-α 水平变化不明显。巫顺秀等【16】采用ELISA 检测28 例TBM 患者和30例病毒性脑膜炎患者血清和CSF以及31例健康对照组血清的γ- 干扰素水平, 结果TBM患者脑脊液γ- 干扰素含量明显高于病毒性脑膜炎组, 且重叠性很小, 而两组血清含量很低并相近, 与健康对照组比较无显著差异, 因而得出用CSF 中γ- 干扰素诊断TBM 的敏感性、特异性、准确性分别为100% 、97. 8% 、98. 5% 。

    CSF中细胞因子水平的变化与炎症反应的强弱有关。测定CSF中细胞因子的水平可反映机体受结核菌感染后的免疫应答状况, 对TBM有临床诊断价值。

    (5)特异性T淋巴细胞的测定

    酶联免疫斑点法( ELISPOT) 作为一种新型的免疫酶技术以探测结核感染者的特异性T细胞来诊断结核病(包括TBM ),结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术的长处, 所以具备一系列的优点: 灵敏度极高, 能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况, 能检测活的免疫细胞的功能与状态, 而且操作简单, 可进行高通量筛选等等。由于其高敏感性和高特异性, 现已在英国、美国及澳大利亚等国家得到广泛临床应用。但该商品试剂盒价格较昂贵, 所以在结核病流行的发展中国家, 是否可推广应用检测方法仍有争议。孟成艳等【17】 采用ELISPOT 探测患者外周血特异性T细胞来诊断TBM, 认为敏感性和特异性均较高, 对早期及鉴别诊断意义重大。Aiken AM 等【18】分别用ESAT-6、CFP-10、PPD 作为诱导抗原, 采用ELISAPOT计数特异性T淋巴细胞, 发现阳性率分别是82%、82%、90%, 跟踪观察得出成功的治疗常伴随着特异性结核杆菌抗原ELISAPOTT淋巴细胞计数的下降。随着结核杆菌特异性抗原研究的不断进展, 抗原特异性T细胞检测的敏感性与特异性也将会不断提高。

    免疫学检查由于使用不同来源的抗原和免疫方法, 以及宿主免疫反映的差别等导致了结果的差异, 而理想的分子诊断技术应该是快速的、有成本效益的、敏感的和特异的方法。

    三、分子生物学检测

    PCR 即体外基因扩增法, 是对结核杆菌DNA的选择性片段进行扩增, 具有敏感, 快速, 特异, 高效等优点,其检测阳性率明显高于涂片法和培养法。但是也存在不足, 如扩增产物DNA污染环境、假阳性及阳性结果不能分辨活菌或死菌等。实时荧光定量巢氏PCR ( real-time quantitative nest PCR), 实现了PCR 从定性到定量的飞跃, 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。Takahashi等利用该方法, 采用结核分枝杆菌MPB64 基因中的22个核苷酸序列为内参照, 检测了9例患者CSF中的细菌拷贝数,敏感性达100%, 样品污染的可能性降至1%以下【19】, 认为实时荧光定量巢氏PCR在结脑的临床诊断中具有很好的应用前景。环介导等温扩增技术,运用环介导等温扩增技术可以在不需常规PCR扩增仪的情况下实现在恒温下对靶核酸进行扩增。与常规PCR相比,该技术更为简便、快速;同时也适合在条件较差的实验室甚至是野外开展。目前,该技术已在结核分枝杆菌的检测中得以应用【20】。有报道显示【21】,针对IS6110序列设计的引物进行的等温扩增技术(最佳反应条件为63℃,时间为60min),该方法敏感度为88.2%,特异度为80.0%;而作为对照的巢氏PCR的敏感度为52.9%,特异度为90.0%。

    目前PCR技术尚不完善, 方法也未规范化, 而且需要严格的质量控制,在不同实验室其结果可以差别很大, 对TBM 诊断的研究还不是很成熟,因此其对TBM 的诊断价值还有待于进一步评价。

    四、细胞学检测

    脑脊液细胞学在中枢神经系统感染的早期诊断中具有重要价值,如鉴别非细菌感染性疾病一般可以根据脑脊液中出现无或偶见的中性粒细胞一般可以排除化脑; 病脑脑脊液细胞学接近正常细胞象。脑脊液细胞形态的主要改变之一是以单核吞噬细胞及巨噬细胞反应, 并且呈团块样分布形成类似组织病理的(无反应性肉芽肿)样改变,这些团块样细胞中分布较多的中性粒细胞是结脑患者脑脊液细胞学另一特点。从Marzia等报道的数据中, 中性粒细胞比例在72%左右, 并且敏感性为95% ( 38 /40),是结脑早期脑脊液改变的一个重要特点, 具有重要价值。在感染早期, 以中性粒细胞增多为主, 白细胞总数很少超过103 /µl,许多粒细胞、异淋细胞和浆细胞同时存在, 此为结核性脑膜炎CSF的一大特点。有研究者认为【22】,中性粒细胞比例在30% ~70%之间,这一比例必须结合细胞学形态特点, 即同时具备类似组织病理的( 无反应性肉芽肿)样改变或具有吞噬细胞反应, 更具有重要的辅助诊断价值。但细胞学检测特异性不高,较少用于临床。闫世明等【23】对766例结核性脑膜炎、103例化脓性脑膜炎、107例病毒性脑膜炎患者脑脊液分别应用细胞玻片离心沉淀器收集CSF细胞、采用迈-格-姬(May-Gruwald-Giemsa, MGG)染色法、光学显微镜分类计数,对CSF细胞进行动态观察。结果766例结核性脑膜炎患者中700例CSF细胞学显示为混合细胞型,占91.38%(700/766),66例显示为淋巴样细胞型,占8.62%(66/766)。103例化脓性脑膜炎患者以中性粒细胞型为主,107例病毒性脑膜炎患者以淋巴细胞型为主。大淋巴样细胞在结核性脑膜炎中的出现率为97.52%(747/766),而化脓性脑膜炎及病毒性脑膜炎则偶见,分别为9.71%(10/103)和14.02%(15/107),结核性脑膜炎随着病情好转,中性粒细胞、大淋巴样细胞逐渐减少。化脓性脑膜炎随着抗炎治疗,中性粒细胞逐渐减少直至消失,病毒性脑膜炎中性粒细胞一般在24h内消失。CSF细胞学的类型及动态变化可以作为鉴别3种脑膜炎的依据之一,并对结核性脑膜炎患者的预后评估有参考作用。

    五、生化检测

    (1)腺苷脱氨酶( ADA) 活性测定。

    ADA 是与细胞免疫有密切关系的核酸代谢酶, 与T淋巴细胞增殖、分化等密切相关。结核分枝杆菌感染后, 引起一系列的免疫反应。一项纳入10篇研究的Meta分析结果显示【24】ADA诊断的敏感度为0.79(95%CI:0.75~0.83),特异度为0.91(95%CI:0.890.93),最近的系统评价【25】回顾了500个实验(最终13个研究纳入Meta分析),该研究结果认为:患者脑脊液中ADA值1~4U/L可排除结核性脑膜炎,5~7U/L不能排除也不能支持结核性脑膜炎,大于8U/L高度怀疑结核性脑膜炎(敏感度为59%,特异度为96%),而大于20U/L可以肯定诊断结核性脑膜炎(特异度为100%,但敏感度只有16%)。但该文也表示,该项研究有许多限制,需谨慎参考。

   (2)乳酸脱氢酶( LDH ) 同工酶活性测定。

    LDH 体内分布广泛, 多种脑部疾病均可引起脑组织中含量增高, 其反应敏感, 但特异性低。而LDH同工酶测定可显著改善其特异性, 在结脑诊断中很有意义, TBM患者LDH4活性升高, 化脓性脑膜炎LDH3活性升高, 病毒性脑膜炎LDH2和LDH1增高。因此, LDH 同工酶活性检测可作为各型脑膜炎鉴别诊断的手段。CSF- LDH 其活性水平可以用来判断急性脑损伤的性质、程度及预后, CSF- LDH活性升高以结核性脑膜炎最明显【26】。

    (3)溶菌酶( LZM )活性测定。

    正常人CSF中LZM 含量甚低, 结核性脑膜炎患者CSF 中LZM含量明显升高, 病情恶化升高者尤为显著, 病情好转则逐渐下降, 痊愈含量为0。结脑CSFLZM含量较正常人明显升高, 检测CSF 中LZM 活性可作为诊断结脑的指标【27】。

    尽管已报道了众多的与结核性脑膜炎诊断有关的检测方法,但目前仍然缺乏既简便快速又十分可靠的技术。究其原因可能与下述几方面相关:(1)脑脊液中Mtb数量很少(每毫升数条Mtb),从而导致细菌学甚至分子生物学检测的假阴性结果。有文献报道2cfu/ml以下PCR法不能检出【28】。(2)对于细胞、生化及免疫学检测而言,又缺乏一个特异度和敏感度非常高且经过临床验证的指标。(3)缺乏系统的方法学评价。虽然,目前报道的脑脊液Mtb检测方法众多,但能通过系统科学方法学评价,且真正可用于临床的方法仍然很少。(4)各实验室检测的规范化及质量控制体系仍需改进。目前,国内2~3级综合性医院及结核病专科医院都开展脑脊液Mtb检测,但各实验室人员素质不一,水平参差不齐。(5)缺乏检测新技术的医学转化,导致基础研究与临床应用的脱节。

    针对结核性脑膜炎实验室检测问题,有研究者认为:(1)各实验室应结合自身条件,采用不同的方法与指标的联合检测对结核性脑膜炎的诊断有着重要意义。(2)系统地对各种脑脊液检测方法进行评价及比较,以了解各方法的特点。(3)进行多学科合作,促进已有的检测新技术的医学转化,继续开发新的方法与技术研究。(4)继续加强实验室规范化及质量控制体系建设,提高实验室人员的能力及素质。(5)也需重视结核性脑膜炎患者有关的基础性研究工作。(6)加强临床用药后的观察性研究,以此促进结核性脑膜炎实验室检测技术的发展。

 

 

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